آنزیم‌ها کاتالیست‌های زیستی با اندازه نانومتری هستند که قابلیت‌های کاربردی فراوان و شناخته‌شده‌ای دارند. درگذشته، معمولاً از آنزیم‌ها در صنایع، به‌ویژه در فرایند تولید شوینده‌ها، استفاده می‌شد. در حال حاضر، آنزیم‌ها در زمینه‌های جدیدی مانند سنتز شیمیایی خالص، داروسازی، حسگر زیستی، حذف زیستی آلاینده‌ها، جداسازی زیستی، فرایند PCR، هضم پروتئین‌ها در آنالیز پروتئومیک،و پیل‌های سوختی زیستی کاربرد گسترده‌ای یافته‌اند [۱ و ۲].
اختصاصی‌بودن آنزیم‌ها قابلیت کاربردی فراوان آنها را سبب شده، اما در حال حاضر، طول عمر کوتاه آنزیم‌ها استفاده از آنها را محدود کرده است. بهبود پایداری آنزیم می‌تواند کاربردهای عملی آن را بیشتر کند. استفاده از مواد نانوساختار برای تثبیت و پایدارسازی آنزیم نه‌تنها باعث افزایش پایداری فعالیت آنزیم می‌شود بلکه سایر خواص ویژه آن، به‌عنوان یک سیستم نانوکاتالیست زیستی، را هم تقویت میکند. ازجمله این خواص می‌توان به بارگذاری بالای آنزیم، فعالیت زیاد آنزیم، امکان جداسازی مغناطیسی، و افزایش سرعت انتقال الکترون اشاره کرد [۲ و ۳].۲٫ روش‌های پایدارسازی آنزیم‌ها
افزایش پایداری آنزیم می‌تواند موجب کاهش مقدار مصرفی آنزیم‌ها، افزایش طول عمر راکتورهای آنزیمی، افزایش شانس استفاده دوباره از آنزیم، و نیز حصول سیگنال قوی‌تر در حسگر زیستی شود[۴]. برای افزایش پایداری آنزیم‌ها روش‌های مختلفی وجود دارد، اعم از: تثبیت آنزیم، اصلاح آنزیم، مهندسی پروتئین، و مهندسی محیط پیرامون آنزیم‌ها [۵].
در روش تثبیت آنزیم، مولکول‌های آنزیم ازطریق جذب فیزیکی یا اتصالات کوولانسی بر روی ساختاری با سطح زیاد متصل شده و یا درون ژل یا ساختارهای میکروکپسول کپسوله می‌شوند. به‌طور خاص اتصال از چند نقطه بین آنزیم و ماده یا سطح مورد استفاده برای تثبیت، جلوی بازشدن ساختار درهم‌پیچیده مولکول پروتئین را می‌گیرد و درنتیجه، پایداری افزایش می‌یابد. کریستال‌های آنزیمی با اتصالات عرضی (CLECs) و تجمع‌های آنزیمی با اتصالات عرضی (CLEAs) برپایه اتصالات بین چندین نقطه از مولکول‌های (یا کریستال‌های) آنزیم هستند [۶]. در روش اصلاح آنزیم، با استفاده از افزودن گروه‌های عاملی یا پلیمرها به سطح مولکول‌های آنزیم جهت تغییر خواص سطحی، پایداری آنزیم بهبود می‌یابد[۷]. مهندسی پروتئین شامل تغییر در توالی اسیدآمینه‌های یک آنزیم با هدف حصول یک ساختار ذاتاً پایدارتر و با استفاده از شیوه‌های زیست‌مولکولی، مانند تغییر مستقیم و یا تغییر در سایت فعال، است. از طرف دیگر، روش مهندسی محیط واکنش آنزیم با استفاده از تغییر در محیط اطراف آنزیم، و نه تغییر ساختار آن، سبب افزایش پایداری آنزیم می‌شود [۵ و ۶]. روش‌های مختلف افزایش پایداری آنزیم در شکل ۱ آورده شده‌اند [۵].
روش تثبیت آنزیم به‌علت سهولت بازیابی و احیای کاتالیست، امکان عملیات پیوسته، و سادگی تخلیص محصولات موردتوجه است. اما معمولاً کارایی زیست‌کاتالیستی ضعیف آنزیم تثبیت‌شده سبب کاهش پیشبرد استفاده از فرایندهای زیستی نسبت به فرایندهای شیمیایی شده است. بهبود کارایی زیست‌کاتالیستی با ساخت ساختارهایی به‌عنوان حامل‌هایی برای تثبیت آنزیم امکان‌پذیر است [۸ و ۹].
۳٫ روش‌های تثبیت و افزایش پایداری آنزیم با استفاده از فناوری نانو
اخیراً، فناوری نانو در بهبود روش‌های تثبیت آنزیم بسیار موثر بوده است. کاهش اندازه مواد حامل آنزیم سبب بهبود بازده و کارایی آنزیم تثبیت‌شده می‌شود. در حالت اتصال به سطح، ذرات ریزتر می‌توانند سطح بزرگ‌تری برای اتصال آنزیم‌ها فراهم کنند؛ درنتیجه، بارگذاری آنزیم در واحد جرم ذرات افزایش می‌یابد. در حالت تثبیت آنزیم در مواد متخلخل درمقایسه با مواد متخلخل بزرگ، باتوجه به مسیر نفوذ کوتاه‌تر سوبسترا، مقدار مقاومت انتقال جرم کمتری برای مواد متخلخل ریزتر قابل انتظار است [۴]. در ادامه به بررسی انواع روش‌هایی پرداخته شده که به‌تازگی با استفاده از نانومواد در تثبیت و افزایش پایداری آنزیم ارائه شده است.
۱٫۳٫ استفاده از نانوذرات در تثبیت آنزیم
به‌علت نسبت سطح به حجم بسیار زیاد نانوذرات، مقدار بارگذاری آنزیم روی نانوذرات بسیار زیاد و کارآمد است. در حالت ایده‌آل، استفاده از نانوذرات در تثبیت آنزیم شرایط بهینه‌‌ای، مانند حداقل محدودیت در نفوذ سوبسترا به سطح آنزیم و نیز حداکثر سطح و بارگذاری زیاد آنزیم، را برای تثبیت آنزیم فراهم میکند [۶]. به‌عنوان مثال، اتصال کوولانسی آنزیم لیپاز به نانوذرات γ-Fe2O3 (با استفاده از میدان مغناطیسی می‌توان آنزیم را از محیط واکنش جدا کرد) نمونه‌ای از روش تثبیت آنزیم با استفاده از نانوذرات مغناطیسی است [۵].
۲٫۳٫ استفاده از نانوفیبرها
پراکنده‌شدن نانوذرات در محلول واکنش و بازیابی آنها برای استفاده دوباره یکی از چالش‌های استفاده از نانوذرات در تثبیت آنزیم است. به‌نظر می‌رسد استفاده از نانوفیبرها بتواند تاحدودی این مشکل را رفع کند. برای مثال، نانوفیبرهای الکتروریسی‌شده سطح بسیار بزرگی برای اتصال یا به‌دام‌انداختن آنزیم‌ها ارائه می‌دهند.
نانوفیبرهای متخلخل نیز می‌توانند مسیر نفوذ سوبسترا از محیط واکنش به سایت‌های فعال آنزیم را کاهش دهند. نانوفیبرهای الکتروریسی‌شده مقاومند و به‌راحتی از محیط جدا می‌شوند و نیز می‌توانند به‌صورت متخلخل تولید شوند [۴ و ۶]. به‌منظور افزایش میزان بارگذاری، می‌توان با ایجاد اتصال عرضی بین آنزیم‌ها پوششی از آنزیم‌های کلوخه‌شده روی فیبر تشکیل داد (شکل ۲). البته این روش را می‌توان در مورد انواع دیگر نانومواد، مانند نانوذرات و یا نانولوله‌های کربنی، نیز به‌کار برد [۲].
۳٫۳٫ استفاده از سیلیکای مزوحفره
به مواد مزوحفره به‌عنوان ساپورت مناسب برای کاتالیزورها، ترکیبات ارگانومتالیک، و آنزیم‌ها توجه خاصی می‌شود. در آنزیم‌های درشت‌مولکول باید مواد متخلخل به‌درستی انتخاب شوند، چون درصورتی‌که اندازه آنزیم از اندازه حفرات بزرگ‌تر باشد، جذب آن به‌شدت کاهش می‌یابد [۱۰].
اخیراً، تلاش می‌شود با اصلاح سیلیکای مزوحفره ازطریق افزایش اندازه درونی حفرات و یا کنترل مورفولوژی، جذب آنزیم افزایش داده شود. از آنزیم‌های تثبیت‌شده در مواد مزوحفره می‌توان در حسگرهای زیستی، سنتز پپتیدها، و سفیدسازی زیستی در صنعت کاغذسازی بهره گرفت [۹]. فرایند تثبیت آنزیم در سیلیکای مزوحفره نسبتاً ساده و راحت است؛ چالش مطرح در این زمینه رهایش آنزیم از این ساختارها و درواقع، پایداری عملیاتی کم آنها است [۵ و ۸].
۴٫۳٫ نانوساختارهایی از طریق کپسوله‌کردن آنزیم طی سل – ژل
اولین گزارش در مورد عدم کاهش فعالیت آنزیم درصورت کپسوله‌شدن در ماتریس سل – ژل در سال ۱۹۹۴ ارائه شد؛ از آن به بعد، روش کپسوله‌کردن آنزیم با فرایند سل – ژل به روشی محبوب در تثبیت آنزیم بدل شده است. به‌عنوان مثال، در یک شیوه متداول در این روش، تترامتیل‌ارتوسیلیکات یا تترااتیل‌ارتوسیلیکات به سل هیدرولیز می‌شود؛ سپس افزایش محلول آنزیم به سل سبب شروع واکنش رسوبدهی و تشکیل ژل می‌شود. به این ترتیب، آنزیم‌ها در ماتریس سیلیکات احاطه و اصطلاحاً کپسوله می‌شوند. در این شیوه حفرات و کانال‌هایی با اندازه‌ای در حدود ۰/۱ تا ۵۰۰ نانومتر در ماتریس نهایی تشکیل می‌شود. فرایند باید به‌خوبی کنترل و بهینه شود تا از رهایش آنزیم جلوگیری شود. در این روش تا حدود زیادی از بازشدن و تغییر ماهیت آنزیم جلوگیری می‌شود [۴ و ۶].
۵٫۳٫ نانوذرات تک‌آنزیم (SENs)
یک راه جدید برای تثبیت آنزیم، که اولین‌بار در سال ۲۰۰۳ ارائه شد، سنتز نانوذرات تک‌آنزیم است. در این روش هر مولکول آنزیم با یک شبکه کامپوزیتی آلی / معدنی متخلخل احاطه می‌شود [۱۱].
تولید نانوذرات تک‌آنزیم روشی جدید برای تثبیت آنزیم ارائه می‌دهد که با سایر روش‌ها (ازجمله، تثبیت آنزیم در مواد متخلخل یا کپسوله‌کردن آن در سل – ژل، پلیمر، یا ساختارهای کامپوزیتی توده) متفاوت است. تبدیل آنزیم‌های آزاد به SENs سبب پایداری فوق‌العاده زیاد فعالیت کاتالیستی آنزیم‌ها می‌شود. این در حالی است که محدودیت چندانی در انتقال جرم سوبسترا به سطح آنزیم رخ نمی‌دهد [۲]. همان‌طور که در شکل ۳ مشاهده می‌شود، در این روش ابتدا سطح آنزیم با پیوندهای کوولانسی (مثلاً، گروه‌های وینیل) اصلاح می‌شود؛ سپس هرکدام از آنها پلیمریزه شده و در مرحله بعدی، اتصالات عرضی بین این رشته‌ها برقرار و نهایتاً نانوذرات تک‌آنزیم تشکیل می‌شوند [۶].
۴٫ کاربردها
همان‌طور که توضیح داده شد، استفاده از مواد نانوساختار برای تثبیت و پایدارسازی آنزیم نه‌تنها فعالیت آنزیم را پایدارتر میکند که سایر خواص ویژه آن به‌عنوان یک سیستم نانوکاتالیست زیستی را نیز تقویت میکند. از مهم‌ترین کاربردهای این نانوساختارهای آنزیمی می‌توان به حسگرهای زیستی، حذف و تصفیه زیستی، تبدیل زیستی، عامل ضدچسبندگی مولکول‌های زیستی،و پیل‌های سوختی زیستی اشاره کرد [۲]. در ادامه به‌شکل مختصر به بررسی برخی از این کاربردها می‌پردازیم.
۱٫۴٫ حسگرهای زیستی آنزیمی
حسگر زیستی آنزیمی از خاصیت اختصاصی‌بودن یک واکنش آنزیمی بهره می‌برد و معمولاً سینتیک واکنش آنزیمی به‌وسیله سرعت تولید یک محصول یا ازبین‌رفتن یک ماده اولیه دنبال می‌شود. اگر محصولات یا واکنش‌دهنده‌ها الکترو – فعال باشند، پیشرفت واکنش را می‌توان مستقیماً به‌وسیله روش آمپرومتری دنبال کرد. در حسگرهای زیستی آنزیمی برپایه الکتروشیمیایی معمولاً از آنزیم‌های اکسیدوردوکتاز (که واکنش کاتالیستی آنها یا الکترون می‌گیرد یا الکترون می‌دهد) استفاده می‌شود [۱۲ و ۱۳]. شکل ۴ اساس عملکرد یک حسگر زیستی آنزیمی الکتروشیمیایی را نشان می‌دهد. انواع مختلفی از آنزیم‌ها درحسگرهای زیستی استفاده می‌شوند؛ ازجمله، آنزیم‌های ردوکس (مانند الکل دی‌هیدروژناز، آلدئید دی‌هیدروژناز، گلوکزاکسیداز، گلوتامیناز، هورس‌ردیش پراکسیداز، زانتین اکسیداز، کولین اکسیداز، اوره‌آز، بیلیروبین اکسیداز، و لاکتیت اکسیداز)، و انواع آنزیم‌های هیدرولیتیک (مانند لیپاز و اِسترآز) [۱۲]. نکته قابل توجه در مورد حسگرهای زیستی آنزیمی این است که تثبیت آنزیم روی سطح الکترود یک قدم ضروری در رسیدن به کارایی بالاتر الکترود آنزیمی است [۱۲].
به‌علت اختصاصی‌بودن و انتخاب‌پذیری آنزیم‌ها، این کاتالیست زیستی در ابزارهای تشخیصی و حسگرها بسیار مورد توجه قرار می‌گیرد. البته محدودیت‌های هم وجود دارد، ازجمله: تعداد محدود واکنش‌هایی که امکان کاتالیست آنها را دارند و محدودیت شرایط عملکرد آنزیم‌ها بهدلیل ناپایداری معمول آنها در محیط غیرآبی و دمای بالا. بهبود طول عمر الکترود آنزیمی و سرعت انتقال الکترون و کوچک‌سازی الکترودهای آنزیمی اهداف اصلی تحقیقات بین رشته‌ای در این زمینه است [۱۴].
۲٫۴٫ پیل‌های سوختی زیستی
پیل سوختی زیستی برپایه آنزیم‌ها سیستمی است که با استفاده از زیست‌سوخت‌هایی مانند گلوکز، فروکتوز، اتانول، و روغن، الکتریسیته تولید میکند. پیل‌های سوختی زیستی آنزیمی می‌توانند به‌عنوان منبع انرژی برای حسگرهای با توان کم، ابزارهای ارتباطی، و ایمپلنت‌های پزشکی استفاده شوند؛ هرچند که کاربرد عملی این پیل‌ها بهدلیل طول عمر کوتاه ناشی از پایداری ضعیف آنزیم و نیز چگالی‌توان کم پیل، محدود شده است [۱۲].
در پیل‌های سوختی متداول، مانند پیل‌های سوختی مستقیم متانول، از کاتالیست‌های فلزی گران‌قیمت بهره می‌گیرند، درحالی‌که در پیل‌های سوختی زیستی از آنزیم استفاده می‌شود که دارای خاصیت ویژه اختصاصی‌بودن نیز هست.
در آند یک پیل سوختی زیستی می‌توان از آنزیم‌های مختلفی مانند گلوکزاکسیداز، الکل‌دهیدروژناز، و آلدهیددهیدروژناز برای اکسیداسیون سوخت‌ها استفاده کرد که منجر به تولید پروتون و الکترون می‌شود. در کاتد از لاکتاز یا بیلیروبین اکسیداز برای کاتالیزکردن واکنش یک اکسنده (معمولاً اکسیژن) با این الکترون‌ها و پروتئین‌ها و تشکیل آب استفاده می‌شود (شکل ۵) [۲].
مزیت مهم استفاده از آنزیم امکان حذف غشای تبادل پروتون است که به‌علت اختصاصی‌بودن آنزیم‌ها نسبت به سوبسترا حاصل می‌شود و می‌تواند منجر به کوچک‌سازی پیل سوختی زیستی شود. در یک پیل سوختی زیستی متداول حذف غشا منجر به اکسیداسیون بی‌فایده سوخت بدون تولید الکتریسیته می‌شود، چون کاتالیست‌های فلزی اختصاص‌گرایی آنزیم‌ها را ندارند [۲ و ۳].
تثبیت آنزیم می‌تواند در افزایش طول عمر پیل‌های سوختی زیستی بسیار موثر باشد. همچنین پیش‌بینی می‌شود با افزایش میزان بارگذاری آنزیم با به‌کارگیری فناوری نانو در تثبیت آنزیم، چگالی توان هم افزایش یابد. استفاده از نانومواد هادی مانند نانولوله کربنی و نانوذرات طلا نیز می‌تواند در افزایش چگالی توان نقش داشته باشد [۲].
۳٫۴٫ عوامل ضدچسبندگی مولکول‌های زیستی
چسبندگی مولکول‌های زیستی به‌معنی جذب پروتئین‌ها و دیگر مولکول‌های زیستی روی سطوح در مجاورت آب یا سیال زیستی است و سبب ایجاد مشکل در ایمپلنت‌های پزشکی، حسگرهای زیستی، و غشاها خواهد شد. تلاش‌های فراوانی برای ساخت پوشش‌ها و غشاهای ضدچسبندگی مولکول‌های زیستی انجام شده است. هدف این تلاش‌ها جلوگیری از مشکلات مرتبط با چسبندگی مولکول‌های زیستی یا کاهش این مشکلات است [۱۵]. یک روش زیست‌محیطی مقابله با این مسئله استفاده از آنزیم‌ها در رنگ‌ها و پوشش‌های ضدچسبندگی مولکول‌های زیستی است. مثلاً، پروتئازها به رنگ‌های ضدچسبندگی مولکول‌های زیستی افزوده می‌شوند تا اتصال پروتئین‌ها به سطوح را کاهش دهند و از تشکیل چسب‌های پروتئینی به‌وسیله میکروارگانیسم‌ها برای اتصال به سطوح جلوگیری کند. در سیستم‌های نانوکاتالیستی زیستی افزایش پایداری آنزیم‌ها می‌تواند سبب کاهش موثر در اتصال پروتئین‌ها روی سطح شود. به‌عنوان مثال، فیلم‌های کاتالیستی زیستی برپایه پروتئاز – نانولوله کربنی تک‌دیواره در یک ماتریس پلیمری پایداری آنزیمی بهتری نسبت به آنزیم آزاد در محلول نشان می‌دهند؛ نیز می‌توانند به‌عنوان فیلم‌های نانوکامپوزیتی خودتمیزکننده برای مقابله با اتصال پروتئین‌ها استفاده شوند. بنابراین، پیش‌بینی می‌شود که این سیستم‌های نانوکاتالیستی زیستی با خاصیت ضدچسبندگی مولکول‌های زیستی و تمیزشوندگی بتوانند در ساخت پوشش‌های ضدچسبندگی مولکول‌های زیستی با طول عمر زیاد استفاده شوند؛ آنها در جلوگیری از اتصال میکروارگانیسم‌ها روی سطح جداره کشتی، ایمپلنت‌های پزشکی، حسگرها، و غشاها کاربرد خواهد داشت [۲].
۵٫ جمع‌بندی
مدت زیادی است که بشر از آنزیم به‌عنوان کاتالیست زیستی در صنایع مختلف بهره می‌گیرد. از مهم‌ترین جنبه‌های کاربردی آنزیم‌ها استفاده از آنها در ابزارهای تشخیصی در صنعت، پزشکی، و محیط زیست (ازجمله، در حسگرهای زیستی، پیل‌های سوختی زیستی، عوامل ضدچسبندگی مولکول‌های زیستی، و…) است. با ورود فناوری نانو به علوم زیستی و زیست‌فناوری، دانشمندان به فکر افتادند از این فناوری برای رفع معایب زیست‌کاتالیست‌ها استفاده کنند. بهره‌گیری از فناوری نانو و نانوساختارها در تثبیت آنزیم‌ها یکی از شیوه‌های جدید در افزایش کارایی و پایداری آنزیم‌ها است، شیوه‌ای که می‌تواند موانع و چالش‌های پیش روی کاربردهای متنوع آنزیم‌ها را کاهش دهد.
منابـــع و مراجــــع
۱٫ K. Sambamurthy, A. Kar, PHARMACEUTICAL BIOTECHNOLOGY, New Age International Pub., (2006) , 309-327.
۲٫ J. Kim,J.W. Grate, P. Wang, “Nanobiocatalysis and its potential applications”, Trends in Biotechnology, 26, (2008) ,639-646.
۳٫ J. Kim, H. Jia, P. Wang “Challenges in biocatalysis for enzyme-based biofuel cells”, Biotechnology Advances, 24, (2006) , 296-308.
۴٫ J. Ge, D. Li, Z. Liu, Z. Liu, “Recent advances in nanostructured biocatalysts”, Biochemical Engineering Journal, 44, (2009) , 53-59.
۵٫ I. Hegedus, E. Nagy, “Improvement of chymotrypsin enzyme stability as single enzyme nanoparticles”, Chemical Engineering Science, 64, (2009) ,1053-1060.
۶٫ J. Kim, J.W. Grate, P. Wang, “Nanostructures for enzyme stabilization”, Chemical Engineering Science, 61, (2006) ,1017-1026.
۷٫ G. DeSantis,J.B. Jones,“Chemical modification of enzymes for enhanced functionality”,Current Opinion in Biotechnology, 10, (1999) ,324-330.
۸٫ D. Brady, J. jordaan, “Advances in enzyme immobilization”, Biotechnology Letters, 31, (2009) ,1639-1650
۹٫ C.H. Lee, T.S. Lin, C.Y. Mou,“Mesoporous materials for encapsulating enzymes”, Nanotoday, 4, (2009) ,165-179.
۱۰٫ P. Wang, “Nanoscale biocatalyst systems”, Current Opinion in Biotechnology, 17, (2006) ,574–۵۷۹٫
۱۱٫ J. Kim, J.W. Grate, “Single-Enzyme Nanoparticles Armored by a Nanometer-Scale Organic/Inorganic Network”, Nanoletters, 3, (2003) ,1219-1222.
۱۲٫ A.K. Sarma, P. Vatsyayanb, P. Goswami, S.D. Minteer, “Recent advances in material science for developing enzyme electrodes”, Biosensors and Bioelectronics, 24, (2009) , 2313-2322.
۱۳٫ K. Karmen, M. Saito, S. Yamamura, Y. Takamura, E. Tamiya, ”Nanomaterial-based electrochemical biosensors for medical applications”, Trends in Analytical Chemistry, 27, (2007) , 585-592.
۱۴٫ E. Bakker., “Electrochemical Sensors”, Analytical Chemistry, 78, (2006) ,3965-3983.
۱۵٫ A.L. Cordeiro, C. Werner, “Enzymes for Antifouling Strategies”, Journal of Adhesion Science and Technology, 25, (2011) , 2317-2344.
بدون دیدگاه